产品介绍

产品货号：LS0034

储存条件：-20℃避光保存，有效期见外包装。

产品介绍

LS SE（or NHS ester）是我司生产的具有氨基反应活性的一类荧光染料。该类染料的SE基团可以与氨基基团反应生产稳定的酰胺键。相比于市面上其他同类染料，LS是稳定性更强、水溶性更好、荧光强度更优的新一代荧光染料。效能等同于CF®405M Dye。

使用方法（以标记IgG抗体为例）

1. 实验材料

（1）IgG：IgG不可含有能与染料反应的胺类化学物质，如氨基酸、Tris、BSA、明胶等。如果IgG中含有此类化学物质，应用pH~7.4的PBS缓冲液预先透析处理。叠氮类化

合物的存在不会影响标记反应。

（2）无水DMSO

（3）NaHCO3

（4）葡聚糖凝胶G-25透析柱

（5）PBS缓冲液（pH~7.4）

（6）NaN3

（7）BSA

2. 标记方法和步骤

（1）准备标记抗体

用0.1 M的NaHCO3溶液（pH~8.3）稀释抗体，使抗体终浓度为2.5 mg/mL。如果产品预先用磷酸盐缓冲液稀释，如PBS缓冲液（不含胺基类化合物），那么可以直接在该缓冲液中加入约1/10体积1M的NaHCO3母液，使NaHCO3终浓度为0.1 M。

注：蛋白浓度为2.5 mg/mL时，标记效率大概为35%，蛋白浓度低于2.5 mg/mL也可用于标记，但标记效率会降低。当蛋白浓度高于5 mg/mL时，标记效率可能更高。由于缓冲液和蛋白纯度存在差异性，因而更精确的标记效率由实操条件决定。如果蛋白浓度过低，可以通过超滤法进行浓缩。

（2）准备染料储存液

室温预热一管1 μmole的LS SE，在管中加入0.1 mL的无水DMSO，充分涡旋溶解染料，配制浓度为10 mM的染料储存液。如果使用更微量的蛋白进行标记反应，那么染料需要稀释至更低浓度。

注：a. 剩余的染料储存液应于-20℃低温存放，以备后续使用。如果使用无水DMSO配制染料储存液，那么染料至少可以保存一个月。

b. 染料也可以用去离子水配制，但是由于染料在水中会缓慢水解，所以水配制的储液最好现配现用。

（3）标记反应步骤

a. 搅拌或涡旋混匀蛋白溶液，逐步滴加15-25 μL的染料储存液（10 mM），使染料/蛋白的摩尔比在9:1至15:1的范围内。LS SE标记IgG抗体的DOL（结合于每个蛋白分子上的染料数量）范围请参考上表。

b. 在室温下搅拌反应1 h，微量标记时也可在摇床上振荡孵育1 h。

注：在进行结合反应的同时，进行步骤2(4)，平衡葡聚糖凝胶G-25透析柱。

（4）从反应液中分离标记蛋白

a. 用PBS缓冲液（pH~7.4）平衡葡聚糖凝胶G-25透析柱（10 mm×300 mm）。

b. 将步骤3(b)反应溶液加入柱子，并用1×PBS缓冲液洗脱。首先洗脱出来的着色带是染料-蛋白结合物。

注：a. 对于小规模的标记反应，为了避免过度稀释产物，可以使用超滤装置去除结合物中的自由染料。

b. 当结合反应完成后，如不及时分离染料-蛋白结合物，可以加入50 μL 1M赖氨酸终止反应。多数情况下，不需要此操作，因为剩余的未反应的染料在反应最后已经被充分水解。

3. 确定DOL

（1）蛋白浓度的确定

抗体浓度可通过以下公式计算：

C(mg/mL)={[A280 -(Amax×Cf)]/1.4}×稀释因子；

a. C是指实验收集的抗体浓度；

b. 稀释因子是指在光度测量时的稀释倍数；

c. A280和Amax分别是指在280 nm处的吸光度以及在吸收波长处的吸光度；

d. Cf是校正因子，LS SE染料的Cf值请参考上面表格；

注：过柱洗脱的蛋白溶液直接用于吸光度检测可能浓度过大，因此需要稀释到大约0.1 mg/mL。稀释倍数（即稀释因子）需要从起初抗体数量（比如5 mg）以及蛋白液洗脱的总体积来进行预估。

（2）DOL的估算

DOL通过下式计算：

DOL = (Amax×Mwt×稀释因子)/(ε×C)

a. Amax，稀释因子，C值在3(1)中已经明确；

b. Mwt是指IgG的分子量(150,000)；

c. ε是LS SE的摩尔吸光系数，参考第一页表格；

d. 标记LS SE的IgG抗体最适DOL值，请参考第一页表格，DOL值会波动，但也能得到很好的实验效果。

注意事项

1. 荧光染料激发与发射波长会受到溶剂的影响，使用不同溶剂，则激发与发射波长可能会发生变化。

2. 标记的蛋白如需长期储存，推荐加入5-10 mg/mL BSA和0.01-0.03% NaN3，以防止蛋白变性和微生物滋生。放置于4℃避光保存。若加入了终浓度为50%的甘油，可放-20℃保存。可稳定保存一年以上。

3. 操作过程注意避光，搅拌速度应适当以避免产生气泡。

4. 层析柱装柱时，尽量使柱体均匀，柱面平整，无气泡、裂隙。

5. 上样时注意，当柱顶缓冲液与凝胶平面相切时再加样品，洗脱时，当样品走至与凝胶平面相切时再加洗脱液。

6. 影响标记效率的其他因素还包括：温度、反应时间、pH、荧光染料与蛋白的量等，需注意控制。

7. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套。

光谱图

注：LS405 SE（LS405琥珀酰亚胺酯）溶解于水中所测图谱。