2.在Buffer W1⑦中缓慢加入指定量的异丙醇（分析纯，需客户自备），并于“□”内打上“√”，混匀后2~35℃保存。

二．手动操作流程

1.客户自备物品

（1）异丙醇（分析纯）

（2）80%乙醇

（3）单通道移液器：20μL、200 μL、1000 μL

（4）恒温金属浴或水浴锅

（5）漩涡振荡器

（6）垂直混合仪

（7）2/15 mL磁性分离器、50 mL磁性分离器

2. 操作步骤

注意：不同样本体积及其它试剂加样量请参照表1要求！

1.手动提取（以1mL菌液提取为例）

1）富集菌体

收集1mL已培养12~16 h的菌液（OD600=2-3）于2mL离心管，12000 rpm离心1min，弃上清。加入250 μL Buffer L1（检查是否已加入RNase A），振荡至菌体彻底悬浮。

2）裂解菌体

向离心管中加入250 μL Buffer L2，盖紧管盖，立即温和地上下颠倒混匀8-10次，室温放置2min使菌体裂解充分，此时悬液会变得相对粘稠。

*注意：温和的混匀，避免剧烈震荡导致基因组断裂

3）去除基因组和蛋白

3.1向离心管中加入350 μLBuffer L3，立即温和地上下颠倒8-10次，充分混匀，溶液出现白色絮状沉淀；

3.2 *将Beads 1悬液漩涡震荡30 s，使磁珠充分震荡重悬；向离心管中加入10 μL Beads 1，立即温和地上下颠倒混匀8-10次；

3.3 *然后将离心管放在磁力架上，磁吸2分钟使上清澄清，（若上清仍有浑浊，可再加入少量5-10μL Beads 1,上下颠倒混匀，再次磁吸）；

3.4取出上清加到新的1.5mL离心管中。

*注意：如离心更方便，可将3.2-3.3步省去，改用12000rpm离心10-15min去除沉淀。

4）结合质粒

4.1向上述1.5mL离心管中，加入175μL Buffer B1、150μL异丙醇和150μLBeads 2，漩涡震荡10 s后，置于垂直混合仪上反应5min（或室温静置，每1分钟振荡混匀一次）；

4.2然后将离心管放在磁力架上2min，用移液器移去上清液并取下离心管。

5）洗涤

5.1 (可选步骤，若为endA+宿主菌，推荐此步)加入600 μLBuffer W1（检查是否已加入异丙醇），以涡旋振荡器最大转速漩涡震荡至少1min，使磁珠充分重悬，再将离心管置于磁性分离器上直至溶液澄清，移去上清液并取下离心管。

5.2加入600 μL 80%乙醇，以涡旋振荡器最大转速漩涡震荡至少1 min，使磁珠充分重悬，将离心管置于磁性分离器上直至溶液澄清，移去上清液并取下离心管。重复该步骤一次，共洗涤2次。

*注意：最后一步洗涤应尽量除尽洗涤液。

6）干燥

保持离心管于磁性分离器上，于室温下静置5-10 min后，即磁珠表面无明显光泽，取下离心管。

*注意：干燥过程中若发现反应管中有液体残留时，可用小量程移液器吸弃液体。

7）洗脱

加入100 μL Buffer EB，涡旋震荡，或用移液器缓慢吹打磁珠，使磁珠充分重悬。然后于50℃条件下孵育5min。

将离心管置于磁性分离器上直至溶液澄清，转移上清液至新的1.5mL离心管中，此即为纯化得到的质粒DNA，可进行后续实验或保存于-20℃。

2.自动化提取

可以适配市面上大部分品牌核酸提取仪，详细参数请联系我司技术支持或设备厂商技术支持。

表1.手动操作不同样本体积及其它试剂加样量

三．自动化操作流程

可以适配市面上大部分品牌核酸提取仪，详细参数请联系我司技术支持或设备厂商技术支持。

注意事项

1.操作之前，请务必认真阅读本产品手册。

2.到货后请将RNase A放置于2-8℃或-20℃保存。首次使用前将RNase A全部加入到Buffer L1混匀，保存于2~8℃，有效期为6个月。

3.Beads 1和Beads 2的加入量与菌体量以及质粒拷贝数相关，可根据具体情况进行调整用量，磁珠取用前应充分重悬均匀。

4.使用自动化仪器进行Beads 1和沉淀的去除时，如仪器磁性较弱导致磁珠残留，可适当增加0.5-1倍的Beads 1用量。Beads1过量可能会影响最终质粒得率。

5.去基因组和蛋白步骤，也可不使用Beads1，改为12000rpm离心10-15min。

6.应避免对磁珠进行冷冻、离心等操作。

7.磁珠干燥前，应使用移液器吸尽洗涤液。

8.应避免磁珠过度干燥，否则会严重降低核酸洗脱效率。

9.建议使用低吸附的离心管和移液器吸头，避免因粘附磁珠而造成损失。

10.使用前请检查各组分是否存在析出情况，如有析出，请将试剂瓶置于60℃水浴加热溶解后使用。

11.本产品仅供科研使用。