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  • Biotin TUNEL细胞凋亡试剂盒

    产品货号: T6068S/T6068L

    产品规格: 20T/50T

    目录价(元):1105/2211

    推荐仪器:荧光显微镜(主推)、流式细胞仪

    大包装询价


产品概述:

储存条件
-20℃保存,组分A 、E 、F、G需避光,避免反复冻融。有效期见外包装

产品内容:

规格

组分                  

  T6068S (20T)

  T6068L (50T)

A. Biotin TUNEL Reaction Buffer

1 mL

2 × 1.25 mL

B. TdT Enzyme

20 μL

50 μL

C. Streptavidin-HRP

20 μL

50 μL

D. Streptavidin-HRP稀释液

1 mL

2 × 1.25 mL

E. DAB浓缩液(20×

50 μL

125 μL

F. DAB稀释液

1 mL

2 × 1.25 mL

G.显色增强剂(10×

100 μL

250 μL

H. Proteinase K (2 mg/mL)

40 μL

100 μL

I. DNase I (2 U/μL)

5 μL

13 μL

J. 10× DNase I Buffer

100 μL

260 μL

产品介绍
细胞发生凋亡时, 会激活一些DNA内切酶,这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA,产生180 bp-200 bp的DNA 片段,表现为琼脂糖凝胶电泳中呈现的特异的梯状Ladder图谱。基因组DNA双链或单链断裂时会出现产生大量的粘性3'-OH末端,可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的催化作用下,与生物素(Biotin)- dUTP结合,从而通过光学显微镜直接进行凋亡细胞的检测,这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(Terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有3'-OH形成,很少能够被染色。Tunel法可以对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征,可检测出极少量的凋亡细胞,因而在细胞凋亡的研究中广泛采用。
本试剂盒应用范围广,可用于检测冷冻或石蜡切片中的细胞凋亡情况,也可检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。可选择性的检测凋亡细胞,而非坏死细胞或因辐照和药物治疗而造成的DNA链断裂的细胞。

注意事项
1.使用前请将产品瞬时离心至管底,再进行后续实验。
2.叠氮化钠对HRP有抑制作用,实验中请勿使用含有叠氮化钠的试剂。
3.组分A、E、F、G使用时请佩戴口罩、手套,如接触皮肤,请立即用大量水冲洗。
4.为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作 。


说明书:


 UE-T6068S/T6068L    

常见问题解答:


为什么出现了一些非特异标记?

1. 有些细胞或组织,比如平滑肌核酸酶或聚合酶活性水平较高,使得DNA全部被切断,易导致假阳性。建议:取出细胞或组织后要立即固定并充分固定,以阻止这些酶的活性,同时设置阴性对照。
2. 内源性过氧化物酶影响,建议:对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织,适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度。
3. 固定液浓度过高或过低,导致组织中心部分固定效果不佳,而使得中心部细胞自溶、DNA链出现不规则断裂,产生假阳性。建议:推荐使用4%多聚甲醛。
4. TdT 酶反应时间过长或Tunel反应过程中反应液发生蒸发或渗漏,细胞或组织表面不能保持湿润。注意控制反应时间,并确保TdT 酶反应液能很好地覆盖样品。
5. 石蜡、脂肪、血液、体液等都较易与染料结合,所以组织切片制作时要保持干净、脱蜡要彻底。
6. 有些试剂或细胞存在自发荧光,选择染料时要避开自发荧光的颜色。

为什么没有染上荧光?
1. 固定不充分。固定液首选4%多聚甲醛,现用现配。不建议使用乙醇,乙醇固定液对组织的渗透力较弱,影响TUNEL标记效率.
2. 细胞膜和核膜的通透不充分,TdT酶未能到达核内。细胞与冰冻切片,可用0.2% Triton X-100溶液通透5-30min,石蜡切片推荐使用蛋白酶K,37℃通透30 min;不同的细胞和组织所需要的通透时间略有不同,时间太长容易脱片,适当调整。
3. 延长标记时间至2h,并适当增加TdT酶及dUTP的用量。
4. 确定实验对象细胞有凋亡。准备一份DNase I处理的阳性对照,验证TdT酶反应是否正确进行。

如何对细胞核进行复染?
可在TUNEL反应结束后对细胞核进行染色。

为什么荧光背景高?
1. 支原体污染:可以使用支原体染色检测试剂盒验证。
2. TdT 酶反应时间过长,可以用试剂盒提供的TdT酶稀释液将TdT酶稀释2-5倍后再按照说明书操作,稀释后的TdT酶仅供当日使用。
3. 处于高速分裂和增殖状态中的细胞,有时也会出现细胞核中的DNA 断裂。建议:在非高增殖期取样检测;
4. 有些试剂或细胞存在自发荧光,选择染料时要避开自发荧光的颜色。
5. DAB 孵育时间过长,减少DAB 染色时间。
6. Biotin-X-dUTP 的非特异性结合,在TdT 酶反应之后,再用含0.1% Triton X-100 和1 mg/ml BSA 的PBS 洗三次。

标记率低?
1. 乙醇、甲醇或甲醛(市面上购买的甲醛大多含有甲醇)固定的样品标记效率较低(因为在固定时染色质未能与蛋白质交联,而在操作中丢失),采用推荐的固定液。
2. 固定时间过长,导致交联程度过高,减少固定时间。
3. 贴壁细胞如果使用药物诱导凋亡,会细胞皱缩,贴壁黏附力降低,导致凋亡细胞容易脱落。建议:在凋亡诱导结束后,可以对多孔板进行1000g离心5min,然后再吸出培养基并用PBS洗涤。如果没有适合的离心机,请注意操作轻缓,防止发生凋亡的细胞在洗涤时被洗去。后续整个操作也需要轻缓。

在蛋白酶K中消化组织样品多久?
大部分组织样品需要充分消化15分钟。最佳的培养时间根据组织类型和厚度而不同。脑组织比其他组织需要更长的蛋白酶处理时间。 

实验的组织切片应该多厚?
老鼠肠、肾脏、肝脏、心脏和结肠厚度5–20 µm。

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