产品概述：
储存条件
-20 ℃ 保存，有效期见外包装
产品内容
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规格 组分 |
T6068S（20 T） |
T6068L（50 T） |
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A. Biotin TUNEL Reaction Buffer |
1 mL |
2 × 1.25 mL |
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B. TdT Enzyme |
40 μL |
100 μL |
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C. Streptavidin-HRP |
20 μL |
50 μL |
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D. Streptavidin-HRP稀释液 |
1 mL |
2 × 1.25 mL |
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E.DAB浓缩液（20×） |
50 μL |
125 μL |
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F. DAB稀释液 |
1 mL |
2 × 1.25 mL |
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G.显色增强剂（10×） |
100 μL |
250 μL |
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H. Proteinase K（2 mg/mL） |
40 μL |
100 μL |
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I. DNase I（2 U/μL） |
5 μL |
13 μL |
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J. 10× DNase I Buffer |
100 μL |
260 μL |
注：（1）组分A、C、E、F需避光保存。（2）组分B、C、H、I请注意冰上操作。（3）组分F避免反复冻融，建议分装保存。（4）使用前请将产品瞬时离心至管底，再进行后续实验。
产品介绍
细胞发生凋亡时，一些DNA内切酶被激活，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA，产生180 bp-200 bp的DNA 片段，断裂的DNA片段暴露出大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的催化作用下，与生物素（Biotin）-dUTP结合，随后和辣根过氧化物酶（HRP）标记的Streptavidin（Streptavidin-HRP）结合，最后在HRP的催化下通过DAB显色来显示凋亡细胞，从而通过光学显微镜直接进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（Terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling, TUNEL）。
本试剂盒应用范围广，可用于检测冷冻或石蜡切片中的细胞凋亡情况，也可检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。可选择性的检测凋亡细胞，而非坏死细胞或因辐照和药物治疗而造成的DNA链断裂的细胞。
注意事项
1．使用前请将产品瞬时离心至管底，再进行后续实验。
2．叠氮化钠对HRP有抑制作用，实验中请勿使用含有叠氮化钠的试剂。
3．本产品仅限于科研，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品和药品，不得存放于普通住宅内。
4．为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
常见问题解答：
◆为什么出现了一些非特异标记？
1. 有些细胞或组织，比如平滑肌核酸酶或聚合酶活性水平较高，使得DNA全部被切断，易导致假阳性。建议：取出细胞或组织后要立即固定并充分固定，以阻止这些酶的活性，同时设置阴性对照。
2. 内源性过氧化物酶影响，建议：对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织，适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度。
3. 固定液浓度过高或过低，导致组织中心部分固定效果不佳，而使得中心部细胞自溶、DNA链出现不规则断裂，产生假阳性。建议：推荐使用4%多聚甲醛。
4. TdT 酶反应时间过长或Tunel反应过程中反应液发生蒸发或渗漏，细胞或组织表面不能保持湿润。注意控制反应时间，并确保TdT 酶反应液能很好地覆盖样品。
5. 石蜡、脂肪、血液、体液等都较易与染料结合，所以组织切片制作时要保持干净、脱蜡要彻底。
6. 有些试剂或细胞存在自发荧光，选择染料时要避开自发荧光的颜色。
◆为什么没有染上荧光？
1. 固定不充分。固定液首选4%多聚甲醛，现用现配。不建议使用乙醇，乙醇固定液对组织的渗透力较弱，影响TUNEL标记效率.
2. 细胞膜和核膜的通透不充分，TdT酶未能到达核内。细胞与冰冻切片，可用0.2% Triton X-100溶液通透5-30min，石蜡切片推荐使用蛋白酶K，37℃通透30 min；不同的细胞和组织所需要的通透时间略有不同，时间太长容易脱片，适当调整。
3. 延长标记时间至2h，并适当增加TdT酶及dUTP的用量。
4. 确定实验对象细胞有凋亡。准备一份DNase I处理的阳性对照，验证TdT酶反应是否正确进行。
◆如何对细胞核进行复染？
可在TUNEL反应结束后对细胞核进行染色。
◆为什么荧光背景高？
1. 支原体污染：可以使用支原体染色检测试剂盒验证。
2. TdT 酶反应时间过长，可以用试剂盒提供的TdT酶稀释液将TdT酶稀释2-5倍后再按照说明书操作，稀释后的TdT酶仅供当日使用。
3. 处于高速分裂和增殖状态中的细胞，有时也会出现细胞核中的DNA 断裂。建议：在非高增殖期取样检测；
4. 有些试剂或细胞存在自发荧光，选择染料时要避开自发荧光的颜色。
5. DAB 孵育时间过长，减少DAB 染色时间。
6. Biotin-X-dUTP 的非特异性结合，在TdT 酶反应之后，再用含0.1% Triton X-100 和1 mg/ml BSA 的PBS 洗三次。
◆标记率低？
1. 乙醇、甲醇或甲醛（市面上购买的甲醛大多含有甲醇）固定的样品标记效率较低（因为在固定时染色质未能与蛋白质交联，而在操作中丢失），采用推荐的固定液。
2. 固定时间过长，导致交联程度过高，减少固定时间。
3. 贴壁细胞如果使用药物诱导凋亡，会细胞皱缩，贴壁黏附力降低，导致凋亡细胞容易脱落。建议：在凋亡诱导结束后，可以对多孔板进行1000g离心5min，然后再吸出培养基并用PBS洗涤。如果没有适合的离心机，请注意操作轻缓，防止发生凋亡的细胞在洗涤时被洗去。后续整个操作也需要轻缓。
◆在蛋白酶K中消化组织样品多久？
大部分组织样品需要充分消化15分钟。最佳的培养时间根据组织类型和厚度而不同。脑组织比其他组织需要更长的蛋白酶处理时间。
◆实验的组织切片应该多厚？
老鼠肠、肾脏、肝脏、心脏和结肠厚度5–20 µm。
使用本产品的文献：
参考文献
1.Enhanced anti-tumor activity by the combination of TRAIL/Apo-2L and combretastatin A-4 against human colon cancer cells via induction of apoptosis in vitro and in vivo.
应用方向：检测结肠癌细胞的凋亡
2.Antiproliferation and cell apoptosis inducing bioactivities of constitUEnts from Dysosma versipellis in PC3 and Bcap-37 cell lines.
应用方向：检测人前列腺癌细胞株PC3、乳腺癌细胞株Bcap-37、胃癌细胞株BGC-823的凋亡
3.Caudatin-2,6-dideoxy-3-O-methy-β-D-cymaropyranoside 1 induced apoptosis through caspase 3-dependent pathway in human hepatoma cell line SMMC7721.
应用方向：检测人肝癌细胞系SMMC7721的凋亡
4.Chemical constitUEnts of the ethyl acetate extract of Belamcanda chinensis (L.) DC roots and their antitumor activities.
应用方向：检测PC3、MGC-803、Bcap-37和MCF-7细胞系的凋亡
5.Synthesis and cytotoxicity of novel ursolic acid derivatives containing an acyl piperazine moiety.
应用方向：检测胃癌细胞MGC-803和乳腺癌细胞Bcap-37的凋亡
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