产品概述：
产品货号：
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产品货号 |
产品名称 |
Ex/Em (nm) |
产品规格 |
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T6013S |
YF®488 TUNEL细胞凋亡试剂盒 （绿色，通用型） |
490/515 |
20 T |
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T6013L |
50 T |
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T6039S |
YF®555 TUNEL细胞凋亡试剂盒 （橙红色，通用型） |
555/565 |
20 T |
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T6039L |
50 T |
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T6014S |
YF®594 TUNEL细胞凋亡试剂盒 （红色，通用型） |
590/617 |
20 T |
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T6014L |
50 T |
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T6063S |
YF®640 TUNEL细胞凋亡试剂盒 （远红，通用型） |
642/662 |
20 T |
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T6063L |
50 T |
产品规格：
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规格 组分 |
20 T |
50 T |
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A. YF®488/555/594/640 TUNEL Reaction Buffer |
1 mL |
2 × 1.25 mL |
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B. TdT Enzyme |
40 μL |
100 μL |
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C. Proteinase K (2 mg/mL) |
40 μL |
100 μL |
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D. DNase I (2 U/μL) |
5 μL |
13 μL |
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E. 10 × DNase I Buffer |
100 μL |
260 μL |
储存条件：-20℃保存，组分A需避光，避免反复冻融。有效期见外包装。冰袋运输。
应用范围：细胞凋亡检测。
产品介绍
细胞发生凋亡时, 会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA，产生180 bp-200 bp的 DNA 片段，表现为琼脂糖凝胶电泳中呈现的特异的梯状Ladder图谱。基因组DNA双链或单链断裂时会出现产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的催化作用下，与YF® -dUTP结合，从而通过荧光显微镜或流式细胞仪直接进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（Terminal - deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。Tunel法可以对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中广泛采用。
本试剂盒应用范围广，可用于检测冷冻或石蜡切片中的细胞凋亡情况，也可检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。可选择性的检测凋亡细胞，而非坏死细胞或因辐照和药物治疗而造成的 DNA 链断裂的细胞。本试剂盒检测细胞凋亡，耗时短，只需一步染色反应，洗涤后即可检测。
注意事项
1. 使用前请将产品瞬时离心至管底，再进行后续实验。
2. 染色背景较重或非特异性着色明显时可适当减少染色时间。
3. 实验时建议增加阴性对照和阳性对照组。
4. 组分A使用时请佩戴口罩、手套，如接触皮肤，请立即用大量水冲洗。
5. 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
6. 本产品仅限于科研，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
7. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
常见问题解答：
◆为什么出现了一些非特异标记？
1. 有些细胞，比如平滑肌核酸酶或聚合酶活性水平较高，使得DNA全部被切断，易导致假阳性。建议:取出细胞后要立即固定并充分固定，以阻止这些酶的活性，同时设置阴性对照.
2. 固定液浓度过高或过低，导致中心部分细胞固定效果不佳，而使得中心部细胞自溶、DNA链出现不规则断裂，产生假阳性。建议:推荐使用4%多聚甲醛。
3. TdT 酶反应时间过长或Tunel反应过程中反应液发生蒸发或渗漏，细胞表面不能保持湿润。注意控制反应时间，并确保TdT 酶反应液能很好地覆盖样品。
4. 有些试剂或细胞存在自发荧光，选择染料时要避开自发荧光的颜色。
◆为什么没有染上荧光？
1. 固定不充分。固定液首选4%多聚甲醛，现用现配。不建议使用乙醇，乙醇固定液的渗透力较弱，影响TUNEL标记效率。
2. 细胞膜和核膜的通透不充分，TdT酶未能到达核内。细胞可用0.2% Triton X-100溶液通透5-30min，不同的细胞所需要的通透时间略有不同，适当调整。
3. 延长标记时间至2h，并适当增加TdT酶及dUTP的用量。
4. 确定实验对象细胞有凋亡。准备一份DNase I处理的阳性对照，验证TdT酶反应是否正确进行。
◆如何对细胞核进行复染？
可在TUNEL反应结束后对细胞核进行染色。
◆为什么荧光背景高？
1. 支原体污染：可以使用支原体染色检测试剂盒验证。
2. TdT 酶反应时间过长，可以用试剂盒提供的TdT酶稀释液将TdT酶稀释2-5倍后再按照说明书操作，稀释后的TdT酶仅供当日使用。
3. 处于高速分裂和增殖状态中的细胞，有时也会出现细胞核中的DNA 断裂。建议：在非高增殖期取样检测；
4. 有些试剂或细胞存在自发荧光，选择染料时要避开自发荧光的颜色。
5. DAB 孵育时间过长，减少DAB 染色时间。
6. Biotin-X-dUTP 的非特异性结合，在TdT 酶反应之后，再用含0.1% Triton X-100 和1 mg/ml BSA 的PBS 洗三次。
◆标记率低？
1. 乙醇、甲醇或甲醛（市面上购买的甲醛大多含有甲醇）固定的样品标记效率较低（因为在固定时染色质未能与蛋白质交联，而在操作中丢失），采用推荐的固定液。
2. 固定时间过长，导致交联程度过高，减少固定时间。
3. 贴壁细胞如果使用药物诱导凋亡，会细胞皱缩，贴壁黏附力降低，导致凋亡细胞容易脱落。建议：在凋亡诱导结束后，可以对多孔板进行1000g离心5min，然后再吸出培养基并用PBS洗涤。如果没有适合的离心机，请注意操作轻缓，防止发生凋亡的细胞在洗涤时被洗去。后续整个操作也需要轻缓。
使用本产品的文献：
1.VEGF-C/VEGFR-3 axis protects against pressure-overload induced cardiac dysfunction through regulation of lymphangiogenesis
Qiu-Yue Lin, Yun-Long Zhang, Jie Bai, Jin-Qiu Liu, Hui-Hua Li
Clin Transl Med
2.Naringin interferes doxorubicin-induced myocardial injury by promoting the expression of ECHS1
Zirui Zhao，Shilei Yang，Yawen Deng，Liang Wang，Yifen Zhang，Zhenyu Feng，Han Li，Zhongchao Chi，Yunpeng Xie and Deshi Dong
Frontiers in Pharmacology
参考文献
1.Apoptosis caused by Hsp90 inhibitor geldanamycin in Leishmania donovani during promastigote-to-amastigote transformation stage应用方向：细胞凋亡染色&流式分析
2.OGG1-initiated base excision repair exacerbates oxidative stress-induced parthanatos
Ruoxi Wang, Chunshuang Li, Ping Qiao, Yaoyao XUE, Xu Zheng, Hongyu Chen, Xianlu Zeng,Wenguang Liu, Istvan Boldogh, XUEqing Ba
Cell Death&Disease(2018)
应用方向：流式分析
Fengyan Zhang,Weihao Song,Ruiyan Yang, ..., Jie Qi, Quanqi Zhang,Yan He
应用方向：使用TUNEL测定法分析了不同发育阶段正常发育的交配（MG）和停滞发育的非交配（NMG）卵巢中的卵巢卵泡凋亡
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