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储存条件：-20℃保存，组分A需避光，避免反复冻融。有效期见外包装。冰袋运输。

应用范围：细胞凋亡检测。

产品介绍

细胞发生凋亡时, 会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA，产生180 bp-200 bp的 DNA 片段，表现为琼脂糖凝胶电泳中呈现的特异的梯状Ladder图谱。基因组DNA双链或单链断裂时会出现产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的催化作用下，与YF^® -dUTP结合，从而通过荧光显微镜或流式细胞仪直接进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（Terminal - deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。Tunel法可以对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中广泛采用。

本试剂盒应用范围广，可用于检测冷冻或石蜡切片中的细胞凋亡情况，也可检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。可选择性的检测凋亡细胞，而非坏死细胞或因辐照和药物治疗而造成的 DNA 链断裂的细胞。本试剂盒检测细胞凋亡，耗时短，只需一步染色反应，洗涤后即可检测。

注意事项

1. 使用前请将产品瞬时离心至管底，再进行后续实验。

2. 染色背景较重或非特异性着色明显时可适当减少染色时间。

3. 实验时建议增加阴性对照和阳性对照组。

4. 组分A使用时请佩戴口罩、手套，如接触皮肤，请立即用大量水冲洗。

5. 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

6. 本产品仅限于科研，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

7. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

1. 为什么出现了一些非特异标记？

1)有些细胞，比如平滑肌核酸酶或聚合酶活性水平较高，使得DNA全部被切断，易导致假阳性。建议:取出细胞后要立即固定并充分固定，以阻止这些酶的活性，同时设置阴性对照。
2) 固定液浓度过高或过低，导致中心部分细胞固定效果不佳，而使得中心部细胞自溶、DNA链出现不规则断裂，产生假阳性。建议:推荐使用4%多聚甲醛。
3) TdT 酶反应时间过长或Tunel反应过程中反应液发生蒸发或渗漏，细胞表面不能保持湿润。注意控制反应时间，并确保TdT 酶反应液能很好地覆盖样品。
4) 有些试剂或细胞存在自发荧光，选择染料时要避开自发荧光的颜色。

2. 为什么没有染上荧光？

1) 固定不充分。固定液首选4%多聚甲醛，现用现配。不建议使用乙醇，乙醇固定液的渗透力较弱，影响TUNEL标记效率。
2) 细胞膜和核膜的通透不充分，TdT酶未能到达核内。细胞可用0.2% Triton X-100溶液通透5-30min，不同的细胞所需要的通透时间略有不同，适当调整。
3) 延长标记时间至2h，并适当增加TdT酶及dUTP的用量。
4) 确定实验对象细胞有凋亡。准备一份DNase I处理的阳性对照，验证TdT酶反应是否正确进行。

3 如何对细胞核进行复染？

可在TUNEL反应结束后对细胞核进行染色。

4. 为什么荧光背景高？

1) 支原体污染：可以使用支原体染色检测试剂盒验证。
2) TdT 酶反应时间过长，可以用试剂盒提供的TdT酶稀释液将TdT酶稀释2-5倍后再按照说明书操作，稀释后的TdT酶仅供当日使用。
3) 处于高速分裂和增殖状态中的细胞，有时也会出现细胞核中的DNA 断裂。建议：在非高增殖期取样检测；
4) 有些试剂或细胞存在自发荧光，选择染料时要避开自发荧光的颜色。
5) DAB 孵育时间过长，减少DAB 染色时间。
6) Biotin-X-dUTP 的非特异性结合，在TdT 酶反应之后，再用含0.1% Triton X-100 和1 mg/ml BSA 的PBS 洗三次。

5. 标记率低？

1) 乙醇、甲醇或甲醛（市面上购买的甲醛大多含有甲醇）固定的样品标记效率较低（因为在固定时染色质未能与蛋白质交联，而在操作中丢失），采用推荐的固定液。
2) 固定时间过长，导致交联程度过高，减少固定时间。
3) 贴壁细胞如果使用药物诱导凋亡，会细胞皱缩，贴壁黏附力降低，导致凋亡细胞容易脱落。建议：在凋亡诱导结束后，可以对多孔板进行1000g离心5min，然后再吸出培养基并用PBS洗涤。如果没有适合的离心机，请注意操作轻缓，防止发生凋亡的细胞在洗涤时被洗去。后续整个操作也需要轻缓。