实验步骤

目标蛋白与磁珠的结合性能将直接影响目标蛋白的纯化效率，各种缓冲液配制也将在一定程度上影响目标蛋白的回收率和纯度。因此，在较大规模蛋白纯化之前，用户应该自行设计实验，筛选出适合目标蛋白的缓冲液，包括Binding/Washing Buffer（Buffer A）及Elution Buffer（Buffer B）。以下提供一个较强结合力的GST标签蛋白的纯化流程，供用户参考。

一．缓冲溶液配制

Buffer A：140 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，1.8 mM KH2PO4，pH 7.4

Buffer B：50 mM Tris-HCl，10 mM还原型谷胱甘肽，pH 8.0配制方法：0.1 M Tris溶液50 mL，0.307 g还原型谷胱甘肽，然后用0.1 M盐酸调pH到8.0，加去离子水至100 mL。

注：可等比例放大缩小。

注：（1）还原型谷胱甘肽容易被氧化，Buffer B要求现配现用（请按需溶解，防止氧化，请勿一次性全部溶解）；

（2）不同的GST融合蛋白与磁珠结合的强弱程度不同，对大部分的GST融合蛋白，使用含有10 mM还原性谷胱甘肽的Buffer B即可洗脱目标蛋白；对少数结合能力较强的GST融合蛋白，可以适当延长洗脱时间，增加洗脱次数，或提高Buffer B中还原型谷胱甘肽的浓度；

（3）Buffer A和Buffer B中可以添加1~5 mM EDTA、1~10 mM DTT、0.1~1.0% Triton X-100、0.1~1.0% Tween 20等，以提高目标蛋白的稳定性。

二．样品处理

本说明书提供以下三种样品的处理方法：

1. 大肠杆菌、酵母等细胞内表达蛋白：表达细胞用适量Buffer A稀释，加入蛋白酶抑制剂（如终浓度为1 mM的PMSF）；冰浴超声裂解细胞，即为粗蛋白样品。如果样品过于粘稠，可根据需要在粗样品中加入适量核酸酶，在冰上放置30 min，以降解核酸。另外，如果目标蛋白含量较低，建议将粗蛋白样品进行离心操作。

2. 胞外表达蛋白：取胞外表达上清，用等量Buffer A稀释平衡，即为粗蛋白样品。

3.动物细胞胞内表达蛋白：取适量动物细胞，用适量PBS洗涤1次，弃上清；用适量含1%（V/V）Triton X-100或1%（V/V）NP-40的Buffer A重悬；加入蛋白酶抑制剂（如终浓度为1 mM的PMSF）；置于冰上10 min，即为粗蛋白样品。

三．磁珠预处理

一般情况下，磁珠的使用量是由用户根据目标蛋白产量和磁珠载量信息计算获得。例如：采用大肠杆菌表达某目标蛋白，250 mL发酵液收获1 g湿重的菌体，通过预实验估算其目标蛋白产量为5~10 mg，用户需要取10 mL 10%的磁珠悬液用于目标蛋白的纯化。以下即以此为例进行详细说明：

1. 将UE磁珠产品置于漩涡混匀器上充分混匀，用移液器取10 mL磁珠悬液于离心管中；

2. 将离心管置于磁性分离器上，待溶液变澄清后，移去上清液；

3. 加入5~10 mL Buffer A到上述装有磁珠的离心管中，盖紧盖子，漩涡振荡15 s，使磁珠重新悬浮。将离心管置于磁性分离器上，磁性分离，移去上清液，重复洗涤2次。

注：在磁性分离过程中，为了减少磁珠在使用过程中的损耗，待溶液变澄清后，盖紧离心管盖子，保持离心管仍在磁性分离器上，手持磁性分离器与离心管上下翻转数次，使澄清的溶液涮洗离心管盖上残留的磁珠，静置片刻，使溶液重新变澄清。

四．目标蛋白与磁珠结合

1.用10 mL Buffer A悬浮1 g湿重的菌体，进行破碎和裂解后，即为粗蛋白样品；

2.将粗蛋白样品加入到装有预处理磁珠的离心管中，盖紧离心管盖；

3.将离心管置于漩涡混匀器振荡15 s，然后置于旋转混合仪上，室温旋转混合20~30 min（如果需要，可在2~8℃的低温环境下旋转混合约1 h，防止目标蛋白降解）；

4.将离心管置于磁性分离器上进行磁性分离，移出上清液到新的离心管中以备后续检测。从磁性分离器上取下离心管进行后续洗涤步骤。

五．磁珠洗涤

1.加入5~10 mL Buffer A到装有磁珠的离心管中，旋转混合2 min，磁性分离，移出清洗液到新的离心管中，以备取样检测；

2.加入5~10 mL Buffer A到装有磁珠的离心管，使磁珠重新悬浮，将磁珠悬液转移至新的离心管，避免原离心管壁上非特异性吸附蛋白污染目标蛋白；磁性分离，移出上清液到清洗液收集管。

六．目标蛋白洗脱

1.加入2~5 mL Buffer B（用户可根据需要改变洗脱体积调整目标蛋白浓度）于离心管中，盖紧离心管盖，然后将离心管置于旋转混合仪上，室温旋转混合2 min；磁性分离，收集洗脱液到新的离心管中，即为纯化的目标蛋白样品；

2.如果需要，可以重复上述步骤1次，收集样品到新的离心管中，以检测目标蛋白是否洗脱完全。

七．磁珠清洗和保存

磁珠使用后经过简单清洗处理后，可以继续用于后续的纯化操作，也可以长时间保存。用户可根据磁珠使用的情况选择不同的清洗方法，主要有以下几种情况：

1. 重复使用次数较少，结合能力下降不明显时，可以采用高pH和低pH buffer交替洗涤的方式进行清洗。

（1）高pH洗（碱洗）：使用后的磁珠加入10 mL Buffer C（即0.1 M Tris-HCl，0.5 M NaCl，pH 8.5），漩涡振荡60 s，磁性分离，去除上清液一；

（2）低pH洗（酸洗）加入10 mL Buffer D（即0.1 M醋酸钠，0.5 M NaCl，pH 4.5），漩涡振荡60 s，磁性分离，去除上清液；

（3）重复碱洗、酸洗交替清洗2次，共3次。

2. 重复使用次数较多时，由于沉淀、变性或非特异性吸附蛋白积累，导致磁珠结合目标蛋白的能力明显下降。去除沉淀或变性蛋白，可按下面的方法进行洗涤：

（1）先用5 mL 6 M盐酸胍洗涤2次，每次漩涡振荡60 s，磁性分离，去除上清液；

（2）再用10 mL 1×PBS洗涤3次，每次漩涡振荡60 s，磁性分离，去除上清液。

3.去除疏水性结合物质，可按下面的方法进行洗涤：

（1）先用5 mL 70%乙醇或浓度为0.1%的非离子型表面活性剂洗涤3次，每次漩涡振荡60 s，磁性分离，去除上清液；

（2）再用10 mL 1×PBS洗涤3次，每次漩涡振荡60 s，磁性分离，去除上清液。

注：完成情况1或情况2的清洗操作后，如果用户需要继续使用磁珠用于蛋白纯化，需先用Buffer A洗涤2~3次。 如果不需要继续使用，则用20%乙醇洗涤磁珠2~3次后，再加入20%（V/V）乙醇到磁珠中使总体积为10 mL，保存于2~8°C。

蛋白纯化流程的优化

以上操作流程适用于大部分GST融合蛋白的纯化，根据目标蛋白与GST融合蛋白纯化磁珠的结合性能不同，用户可以从以下几个方面对纯化流程进行优化，以提高目标蛋白的回收率和纯度。

1.  提高目标蛋白回收率的参考方法：

（1）延长蛋白溶液与磁珠孵育的时间；

（2）样品及缓冲液中加入1~10 mM的DTT，有助于提高部分GST融合蛋白与磁珠的结合；

（3）添加合适的蛋白酶抑制剂，防止目标蛋白降解；

（4）增加磁珠用量；

（5）延长洗脱目标蛋白的时间或增加洗脱次数；

（6）使用新鲜配制的Buffer B保证目标蛋白洗脱效率。

2.提高目标蛋白纯度的参考方法：

（1）避免剧烈的超声破碎造成GST标签与目标蛋白发生断裂；

（2）在纯化过程中添加合适的蛋白酶抑制剂，防止目标蛋白降解；

（3）在样品溶液和缓冲液中加入0.1%的Tween20或2%的NP-40可降低非特异蛋白的吸附；

（4）延长洗涤时间，增加洗涤次数；

（5）采用梯度浓度还原型谷胱甘肽洗脱目标蛋白。

注意事项

1.首次使用本产品前，请务必详细阅读本用户手册；

2.磁珠使用和保存过程中应避免冷冻、干燥和高速离心等操作；

3.在使用本产品前，请务必充分振荡使磁珠保持均匀的悬浮状态；

4.请选用质量好的移液器吸头和离心管，以免磁珠贴壁或混合过程发生渗漏引起磁珠的损耗；

5.磁珠与溶液混合过程中，如果溶液粘稠无法通过翻转离心管重悬磁珠，可采用移液器反复吹吸或短时漩涡混合使磁珠充分重悬；

6.用户可根据实际需要保留经磁性分离移去的上清液，进行取样检测，以便分析纯化过程和优化蛋白纯化流程；

7.本产品可以重复使用，重复使用时，建议纯化同种蛋白，纯化不同种类的蛋白时，建议使用新的磁珠，以防交叉污染；

8.本产品需与磁性分离器配套使用；

9.本产品仅供研究使用。