实验步骤

缓冲液的准备

目标蛋白与组氨酸标签蛋白纯化磁珠的结合性能将直接影响目标蛋白的纯化效率，而各种缓冲液配制也将在一定程度上影响目标蛋白的回收率和纯度。因此，在较大规模蛋白纯化之前，用户应该自行设计实验，筛选出适合纯化目标蛋白的缓冲液体系，主要包括Binding Buffer、Washing Buffer、Elution Buffer。增加咪唑浓度进行洗脱是组氨酸标签纯化磁珠最常用的洗脱方法，首次使用时，在不确定最佳的洗脱咪唑浓度情况下，推荐在缓冲液中分别加入10 mM、20 mM、50 mM、100 mM、200 mM、300 mM、400 mM、500 mM咪唑，浓度从低到高分别洗脱，磁吸后收集蛋白上清液，之后通过SDS-PAGE电泳方法鉴定洗脱结果。以下提供的缓冲液体系适用于多数组氨酸标签蛋白的纯化，供用户参考。

Binding Buffer：20 mM Phosphate Buffer，500 mM NaCl，5~50 mM Imidazole，pH7.4

Washing Buffer：20 mM Phosphate Buffer，500 mM NaCl，50~100 mM Imidazole，pH7.4

Elution Buffer： 20 mM Phosphate Buffer，500 mM NaCl，500 mM Imidazole，pH7.4

样品处理

本说明书提供3种样本处理方法

1. 大肠杆菌、酵母等细胞内表达蛋白：表达细胞用适量的Binding Buffer稀释，加入蛋白酶抑制剂（如终浓度为1 mM的PMSF），重悬细胞，冰浴超声裂解细胞，即为粗蛋白样品。如果样品过于粘稠，可根据需要在粗样品中加入适量核酸酶，冰浴30 min，以降解核酸。另外，用户也可以根据实际需要对蛋白样品进行离心操作。

2. 胞外表达蛋白：取胞外表达上清，用等量Binding Buffer稀释，即为粗蛋白样品。

3. 动物细胞胞内表达蛋白：取适量动物细胞，先用适量PBS洗涤1次，弃上清；接着用适量含1%（V/V）Triton X-100或1%（V/V）NP-40的Binding Buffer重悬，加入蛋白酶抑制剂（如终浓度为1 mM的PMSF），冰浴10 min，即为粗蛋白样品。

磁珠预处理

一般情况下，磁珠的使用量是由用户根据目标蛋白产量和磁珠载量信息计算获得。例如：采用大肠杆菌表达某目标蛋白，500 mL发酵液收获2 g湿重的菌体，通过预实验估算其目标蛋白产量为10~20 mg，用户需要取5 mL磁珠悬液用于目标蛋白的纯化。以下即以此为例进行详细说明：

1. 磁珠置于漩涡混匀器上充分混匀，用移液器取5 mL磁珠悬液于15 mL离心管中，进行磁性分离*，弃上清液，从磁性分离器上取下离心管。

2. 加入5 mL Binding Buffer到上述装有磁珠的离心管中，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮；进行磁性分离，移去上清液。重复洗涤2次。

（注*：在磁性分离过程中，为了减少磁珠在使用过程中的损耗，待溶液变澄清后，盖紧离心管盖子，保持离心管仍在磁性分离器上，手持磁性分离器与离心管上下翻转数次，使澄清的溶液涮洗离心管盖上残留的磁珠，静置片刻，使溶液重新变澄清）

目标蛋白与磁珠结合

1. 用10 mL Binding Buffer悬浮2 g湿重的菌体，进行破碎和裂解之后，即为目标粗蛋白样品，加入到装有预处理磁珠的离心管中，将离心管置于漩涡混匀器振荡15 s。

2. 将离心管置于旋转混合仪上，室温旋转混合20~30 min（如果需要，可以在2~8℃ 的低温环境下，旋转混1 h，防止目标蛋白降解）。

3. 将离心管置于磁性分离器上进行磁性分离，移出上清液至新的离心管中以备后续检测，从磁性分离器上取下离心管进行后续洗涤步骤。

磁珠洗涤

1. 加入10 mL Washing Buffer到装有磁珠的离心管中，轻轻翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，磁性分离，移出清洗液到新的离心管中，以备取样检测。重复此步骤1次。

2. 加入10 mL Washing Buffer到装有磁珠的离心管，使磁珠重新悬浮，将磁珠悬液转移到新的离心管（避免原离心管壁上非特异性吸附蛋白污染目标蛋白），磁性分离，移出上清液到清洗液收集管。

目标蛋白洗脱

1. 用户可根据需要改变洗脱体积调整目标蛋白浓度，加入2~10 mL Elution Buffer，轻轻翻转离心管数次，使磁珠悬浮，磁性分离，收集洗脱液到新的离心管中，即为纯化的目标蛋白样品。

2. 如果需要，可以重复上述步骤1次，收集样品到新的离心管中，以检测目标蛋白是否洗脱完全。

磁珠后处理

1. 在装有磁珠的离心管中加入5 mL Elution Buffer，上下翻转离心管数次，使磁珠悬浮，磁性分离，去除上清液。

2. 重复上述步骤2次。

3. 在离心管中加入5 mL ddH2O，上下翻转离心管数次，使磁珠悬浮，磁性分离，去除上清液。

4. 重复上述步骤2次。

5. 加入Storage Buffer到磁珠中使总体积为5 mL，保存于2~30℃（长期保存，置于2~8℃），可用于下一次同种蛋白的纯化。

磁珠再生

磁珠连续使用三次以上，其结合目标蛋白的能力可能会明显降低，建议进行磁珠再生处理。

Stripping Buffer：20 mM Sodium Phosphate，500 mM NaCl，100 mM EDTA，pH 7.4

Beads Washing Buffer（可选）：0.5 M NaOH，2 M NaCl

Recharge Buffer：100 mM NiSO4 / CoCl2 （该化学试剂有一定的毒性，可能造成过敏反应，使用时务必注意）

Storage Buffer：20%（V/V）乙醇

以5 mL 10%（V/V）磁珠悬液为例，详细说明磁珠再生操作：

1. 将磁珠悬液进行磁性分离，去除上清液，从磁性分离器上取下离心管，在离心管中加入5 mL ddH2O， 上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，磁性分离，去除上清液。

2. 加入5 mL Stripping Buffer，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，室温旋转混合5 min，磁性分离，去除上清液。重复此步骤1次。

3. 加入5 mL ddH2O，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，磁性分离，去除上清液，重复此步骤 2次。

4. 碱处理：加入5 mL Beads Washing Buffer，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，室温旋转混合5 min，磁性分离，去除上清液。加入5 mL ddH2O，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，磁性分离，去除上清液。重复 ddH2O洗涤步骤3~5次，至洗涤液呈中性为止。

5. 加入5 mL Recharge Buffer，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，室温旋转混合20 min，磁性分离，去除上清液。

6. 加入5 mL ddH2O，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，磁性分离，去除上清液。重复此步骤4次以上，保证镍离子去除完全。

7. 加入Storage Buffer到磁珠中使总体积为5 mL，保存于2~30℃（长期保存，置于2~8℃）。

蛋白纯化流程的优化

以上操作流程适用于大部分组氨酸标签蛋白的纯化，根据目标蛋白与金属离子螯合磁珠的结合性能不同，用户可以从以下几个方面对纯化流程进行优化，以提高目标蛋白的回收率和纯度。

提高目标蛋白回收率的参考方法：

1. 降低样品溶液和Binding Buffer中的Imidazole浓度；

2. 样品溶液和其它缓冲液中添加表面活性剂等物质；

3. 添加合适的蛋白酶抑制剂，防止目标蛋白降解；

4. 增加磁珠用量；

5. 延长蛋白与磁珠孵育的时间；

6. 延长洗脱目标蛋白的时间或增加洗脱次数。

提高目标蛋白纯度的参考方法：

1. 提高样品溶液和Binding Buffer中Imidazole、NaCl的浓度；

2. 样品和缓冲液中添加表面活性剂等物质；

3. 添加合适的蛋白酶抑制剂，防止目标蛋白降解；

4. 延长洗涤的时间，增加洗涤次数；

5. 采用梯度Imidazole浓度洗脱目标蛋白。

注意事项

1. 首次使用本产品前，请务必详细阅读本用户手册；

2. 磁珠使用和保存过程中应避免冷冻、干燥和高速离心等操作；

3. 在使用本产品前，请务必充分振荡使磁珠保持均匀的悬浮状态；

4. 请选用质量好的移液器吸头和离心管，以免磁珠贴壁或混合过程发生渗漏引起磁珠的损耗；

5. 磁珠与溶液混合过程中，如果溶液粘稠无法通过翻转离心管重悬磁珠，可采用移液器反复吹吸或短时漩涡混合使磁珠充分重悬；

6. 用户可根据实际需要保留经磁性分离移去的上清液，进行取样检测，以便分析纯化过程和优化蛋白纯化流程；

7. 本产品可以重复使用，当纯化性能降低时，建议进行再生处理；

8. 使用过的磁珠重复使用时，建议纯化同种蛋白，纯化不同种类的蛋白时，建议使用新的磁珠；

9. 本产品需与磁性分离器配套使用；

10. 本产品仅供研究使用。

磁珠的溶剂耐受性