产品货号：M7414S,M7414M

产品规格：1 mL, 20%(v/v), 10-30 μm;5 mL, 20%(v/v), 10-30 μm

储存条件：2~8℃保存，保质期见外包装

产品介绍

本试剂盒表面为NHS基团修饰，能够与带有伯胺基团的蛋白和其他分子形成稳定的肽键，用于亲和纯化抗体、抗原和其他生物分子。与传统的羧基、氨基磁珠相比，表面含NHS基团的磁珠无需事先采用EDC/NHS或戊二醛进行活化，只需简单地将含伯氨基的生物配体溶解在试剂盒自带的Coupling Buffer中，室温下将蛋白与NHS磁珠混合1~2 h便可将生物配体共价偶联到磁上，具有操作简单、偶联条件温和、生物配体偶联快速高效等优点。磁珠偶联过程必需在不含任何氨基的缓冲溶剂中进行。人工操作时，使用磁性分离架实现磁珠与溶剂分离。也可采用自动化设备操作，自动化操作适合用于多样品的筛选。本试剂盒组成见表1，磁珠的基本信息见表2。

表1. NHS琼脂糖磁珠试剂盒组成

表2. NHS琼脂糖磁珠基本信息

实验步骤

一．蛋白溶液配制

1.取适量待偶联蛋白用Coupling Buffer溶解，配成浓度为0.1-3.0 mg/mL的蛋白溶液。

2.已经保存于buffer中的蛋白，需要通过透析或者脱盐的方法彻底除去原有buffer里含伯胺基的物质，然后再用Coupling Buffer配成浓度为0.1-3.0 mg/mL的蛋白溶液，将配制好的蛋白溶液于4ºC保存备用。

注：（1）为了达到更好的性能，当蛋白浓度≥2 mg/mL时，此时偶联效率会更高，不过需根据成本和使用要求综合考虑；

（2）蛋白溶液中不能含有带伯氨基的成分，比如Tris，甘氨酸，明胶，BSA等。

二．磁珠清洗

1.取500 μL磁珠于1.5 mL EP管中（磁珠取样前要反复颠倒、使用涡旋振荡器或者垂直混合仪使其混合均匀，以保证实验的同一性）。

2.将EP管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液。

3.加1 mL 2~8ºC的预冷的Wash Buffer A于1.5 mL EP管中，涡旋15 s，使磁珠混合均匀。

4.加1 mL 2~8ºC的预冷的Wash Buffer A于1.5 mL EP管中，涡旋15 s，使磁珠混合均匀。

5.将EP管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液。

三．生物配体固定

1．加500 μL蛋白溶液于EP管中，涡旋30 s，使其混合均匀（磁珠洗涤后要立即加入蛋白溶液）。

2．将EP管涡旋15 s，置于垂直混合仪上，室温混合1~2 h。如果垂直混合不均匀，则反应前30 min，每隔5 min取下EP管涡旋15 s。此后，每隔15 min，取下EP管涡旋15 s。（如有需要可以在4ºC反应过夜）

3．采用磁性分离架富集磁珠，保存流穿液。

四．磁珠封闭

1.加1 mL Blocking Buffer于EP管中，涡旋30 s，将EP管置于磁性分离架内，富集磁珠，弃上清液（Blocking Buffer除了本试剂盒中提供的3 M乙醇胺外，也可以使用100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8.0等其它封端试剂）。

2.重复上述步骤操作四次。

3.加1 mL Blocking Buffer于EP管中，涡旋30 s，将EP管置于垂直混合仪中室温反应2 h。

4.将EP管置于磁性分离架内，富集磁珠，弃上清液。

5.加1 mL超纯水于EP管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，弃上清液。

五．保存

1.加1 mL Storage Buffer（需客户自备，比如含0.05%叠氮化钠的PBS缓冲液，或者客户根据自己实际需求选择合适的保存溶液 ）于EP管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，弃上清液。重复该操作2次。

2.加入500 μL Storage Buffer于EP管中，充分混合，4ºC保存备用（最终偶联蛋白后的磁珠浓度为10 mg/mL）。

蛋白偶联操作流程图及优化点

1.其中磁珠洗涤要严格按照说明书，采用的Washing Buffer A快速洗涤 ，以防磁珠在洗涤过程中NHS基团水解

2.蛋白偶联过程中，首先要通过实验确定合适的Coupling Buffer（主要包括Coupling Buffer A；Coupling Buffer B；50 mM硼酸溶液，pH8.5；100 mM磷酸缓冲液，100 mM NaCl，pH 7.4这四种）。

3.确定合适的Coupling Buffer后，再以此Coupling Buffer为基础，确定合适的偶联蛋白浓度，因为蛋白浓度越高，偶联到磁珠上的蛋白的量会越大（这是由于NHS基团跟蛋白偶联和NHS基团本身水解是一对竞争反应）。当然此处要综合考虑使用性能和成本，有些客户偶联少量的蛋白便可满足使用需求，这时采用低浓度的蛋白便可，这样可以降低成本。

4.封闭这一步可以采用试剂盒中自带的3 M乙醇胺，也可使用Tris缓冲液（100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8.0），封闭时间不得低于2 h，如果化学封闭后背景仍然很高，还可以额外加一步BSA封闭。

注意事项

1.磁珠对水分敏感。为了保证产品质量，在取样之后需立即盖上瓶盖，并用封口膜密封，于4℃保存。

2.禁止将磁珠干燥或冷冻。干燥和冷冻操作可能导致磁珠的聚集从而丧失结合活性。

3.可通过间接法（e.g., Thermo Scientific® Pierce® 660 nm Protein Assay, Product No. 22660 and 22662）测定反应前后蛋白含量，或通过直接法（e.g., Thermo Scientific® Pierce® Micro BCA Protein Assay，Product No. 23235）检测偶联到磁珠表面的蛋白含量，使用280 nm附近的波长来测定蛋白含量是不可取的，因为NHS基团在280 nm波长附近有很强的吸收，会严重干扰检测结果。

4.蛋白稳定剂（如BSA，gelatin）会抑制抗体与磁珠的结合，因此在磁珠偶联抗体过程中，需要确保抗体保存体系中不存在含伯氨基的蛋白稳定剂。

5.缓冲液中含有带伯胺的物质会抑制蛋白质偶联到磁珠表面，去除伯胺物质可采用透析和脱盐的方法。

6. NHS基团易水解，故在用Washing Buffer A洗涤时，一定要参照说明书进行。

7. 蛋白溶液要预先配制好，Washing Buffer A洗涤完毕后，要立即加入蛋白溶液进行偶联反应。

8. 蛋白质和磁珠的偶联效率因蛋白质种类和性质差异而不同。一般而言，蛋白质浓度为0.1~3.0 mg/mL时利于蛋白质偶联；然而，对于不同的蛋白其浓度需要优化。