产品概述：
产品货号：M7416S，M7416M，M7416L
产品规格：1 mL, 5 mg/mL,1 μm;5 mL, 5 mg/mL,1 μm; 100 mL, 5 mg/mL,1 μm
储存条件：在2~8℃下保存，有效期见外包装
产品介绍
OligoDT磁珠，分散性好，磁响应快，亲水性好。磁珠表面共价偶联的OligoDT可与真核生物mRNA尾部的Poly A互补配对，可高效地从真核生物总RNA或直接从动植物组织或细胞裂解物中快速分离出完整、高纯度的mRNA。分离得到的mRNA可用于多种分子生物学实验：RT-PCR、固相cDNA文库构建、RACE、Northern等。产品信息见表1。
表1. Oligo DT磁珠信息
|
产品信息 |
OligoDT磁珠（1 μm） |
|
Oligo DT偶联量 |
~ 500pmol/mg磁珠 |
|
mRNA结合量 |
1-2 μg/mg磁珠 |
|
磁珠浓度 |
5 mg/mL |
|
保存溶液 |
1×PBS, 0.01% Tween-20, 0.1% proclin-300 |
实验步骤
一．使用前准备
1.缓冲液：以下为常用的缓冲液成分，用户可根据需要调整缓冲液配方，例如SSC等。
|
结合缓冲液 |
10 mM Tris-HCl（pH 7.5）, 1.0 M NaCl, 1 mM EDTA |
|
裂解/结合缓冲液 |
100 mM Tris-HCl（pH 7.5）, 500 mMNaCl, 10 mM EDTA, 1%SDS, 5 mM DTT |
|
洗涤液I |
10 mM Tris-HCl（pH 7.5）, 0.15 MNaCl, 1 mM EDTA, 0.1%SDS |
|
洗涤液II |
10 mM Tris-HCl（pH 7.5）, 0.15 MNaCl, 1 mM EDTA |
|
洗脱液 |
Nuclease-Free Water |
注：所有试剂需用DEPC处理的纯化水配制，使用时平衡至室温，如有沉淀，可37℃预热10 min。
2. RNase-free 1.5 mL离心管
3. 磁性分离器：可选用UElandy磁性分离器，货号M7429
4. 漩涡振荡器
5. 旋转混合仪
6. 移液器及吸头
二．清洗Oligo DT磁珠
1.将磁珠瓶置于漩涡振荡器上20 s，振荡充分重悬磁珠。用移液器移取所需体积的磁珠到新的离心管中。加入相同体积的结合缓冲液，重悬磁珠。
2.将离心管置于磁性分离器上，静置1 min（此操作后续简称为磁性分离），用移液器吸去上清液，从磁性分离器上取下离心管。
3.加入初始体积相同体积的结合缓冲液，备用。
注：如从总RNA中纯化mRNA，加入一半的初始体积，即磁珠浓缩至10 mg/mL。
三．从总RNA中纯化mRNA
1.例如从100 μg总RNA中纯化mRNA。用DEPC水将100 μg总RNA体积调整到100 μL。
2.加入相同体积的结合缓冲液（100 μL）。
3.65℃加热2 min以打开二级结构，然后迅速转移至冰上。将200 μL总RNA溶液加入至100 μL洗涤后的磁珠。即每100 μg总RNA使用1 mg洗涤后且溶于100 μL结合缓冲液磁珠（步骤2），吹打混合均匀。
4.室温，旋转孵育10 min。
5.磁性分离1 min，小心移去上清。从磁性分离器上取下离心管。
6.加入200 μL洗涤液II，小心吹打混匀。
7.磁性分离1 min，小心移去上清。从磁性分离器上取下离心管。
8.重复洗涤一次（步骤6和7），共洗涤两次。
注：洗涤需将磁珠彻底重悬，并第二次洗涤后尽量去除干净上清。
9. 根据后续实验，选择下列其一：
（1）如不需要将mRNA从磁珠上洗脱下来，需用下游实验的酶缓冲液再洗涤磁珠一次。
（2）如需从磁珠上洗脱mRNA：小心去除干净洗涤缓冲液II（注意不要吸到磁珠），然后添加10~20 μL无酶水或10 mM Tris-HCl （pH 7.5），吹打充分混匀，室温孵育2 min。然后将离心管放在磁力架上，将含有mRNA的上清液转移至新的RNase-free的离心管中。
注：可65℃~75°C加热洗脱，来提高洗脱效率。
四．从细胞裂物中分离mRNA
1.用PBS洗涤细胞悬液，离心获得细胞沉淀。细胞沉淀可以立即使用，也可以在液氮中冷冻后储存在-80℃备用。
2.向细胞沉淀（1~4×106细胞）中加入1 mL裂解/结合缓冲液。反复吹打几次以确保裂解完全。裂解过程中释放的DNA会导致溶液变粘，表明裂解完成。
3.通过DNA剪切步骤降低粘度。裂解液使用1-2 mL注射器通过21号针头处理3次。反复剪切可能会导致裂解物起泡沫，但起泡不应影响mRNA的产量。可以通过30s离心来减少泡沫。
4.裂解物可立即用于mRNA分离，或将其冷冻并保存在–80℃备用。
5.将清洗过的Oligo DT磁珠，磁吸去除上清。加入裂解物，混合均匀。
6.室温旋转混合5 min进行结合。如果溶液粘稠，则增加结合时间。
7.将离心管放在磁力架上1-2 min，除去上清液。
8.磁珠清洗两次：用1 mL洗涤液I洗涤一次，然后用1 mL洗涤液II洗涤一次。
注：洗涤需将磁珠彻底重悬，并在洗涤步骤之间完全去除上清。
9. 根据后续实验，选择下列其一：
（1）如果不需要将mRNA从磁珠上洗脱下来（如后续进行固相cDNA合成），请用洗涤液II（500 μL）再洗涤一次，然后用下游实验中使用的酶缓冲液洗涤一次。
（2）从磁珠上洗脱mRNA：去除干净洗涤液II，然后添加10~20 μL无酶水或10 mM的Tris-HCl（pH 7.5）。65°C~75°C孵育2 min，然后将离心管放在磁力架上，并迅速将含有mRNA的上清液转移至新的RNase-free的离心管中。
注：根据mRNA的丰度，最终产量在不同组织/细胞之间可能会有所不同。一个哺乳动物细胞一般约有10~30 pg RNA，其中mRNA约占其中1~5%。
注意事项
1. 应避免对磁珠进行冷冻等操作。
2. 为减少磁珠损失，每次磁性分离的时间应不少于1 min。
3. 建议提取到的mRNA立即用于RT-PCR。如果需要保存，建议洗脱液中添加RNase抑制剂，将mRNA从磁珠上洗脱下来并且冻存。
4. 所有用于mRNA提取的buffer和耗材都应该是RNase-free。
5. 从磁珠保存管中移取磁珠前应充分震荡重悬均匀。
6. 如果纯化后的rRNA残留量对下游应用过高，可进行第二轮mRNA纯化。
7. 建议使用质量好的移液器吸头和反应管，避免因粘附磁珠及溶液而造成损失。
8. 本产品仅供研究使用。
微信服务号