2. 在洗涤液II中加入瓶身标签指定量的无水乙醇（分析纯），并于“□”内打上“√”，混匀。

3. 在蛋白酶K中加入瓶身标签指定量的溶液A，并于“□”内打上“√”，混匀后保存于-20℃。

二．客户自备物品

1.异丙醇（分析纯）

2.1.5 mL离心管：RNase-free

3.单通道移液器：20 μL、200 μL、1000 μL

4.漩涡振荡器

5.磁性分离器：可选用UE磁性分离器（货号：M7429）。

注：每次使用前，试剂盒与样本需平衡至室温。

三．手动提取流程

1.准备DNase I反应液：取一个1.5 mL离心管，根据样本数N，依次加入80×N μL的洗脱液 、10×N μL的10×Reaction Buffer、10×N μL的DNase I ，使用移液枪缓慢吸移20次或缓慢上下颠倒离心管20次混匀后待用。

注意：DNase I、DNase I反应液不可涡旋！

2.裂解：取新的1.5mL离心管，分别加入200 μL全血样本（不足200 μL时可用PBS或生理盐水补足），再分别加入400 μL裂解液和20 μL蛋白酶K，以涡旋振荡器最大转速涡旋震荡2 min。

3.结合：在离心管内分别加入200 μL异丙醇和20 μL磁珠悬液，以涡旋振荡器最大转速涡旋震荡2 min，室温静置15 min（间隔5 min涡旋震荡30 s）。然后将离心管置于磁性分离器上放置1 min，用移液枪吸弃上清液并取下离心管。

4.洗涤

a. 在离心管内分别加入600 μL洗涤液I（检查是否已加入异丙醇），以涡旋振荡器最大转速涡旋震荡2 min，使磁珠充分重悬（如发现磁珠粘壁，可使用移液枪吸取管内的洗涤液Ⅰ反复吹打下管壁磁珠后再涡旋震荡2 min），将离心管置于磁性分离器上直至溶液澄清，用移液枪吸弃上清液并取下离心管。

b.重复步骤a。

c.在离心管内分别加入600 μL洗涤液II（检查是否已加入无水乙醇），以涡旋振荡器最大转速涡旋震荡2 min，将离心管置于磁性分离器上直至溶液澄清，用移液枪吸弃上清液后室温静置3 min，取下离心管。

5. DNase I处理

a. 在离心管内分别加入100 μL DNase I反应液，使用移液枪吸取管内的DNase I反应液反复吹打下管壁磁珠，确认管壁上所有磁珠都被吹打入反应液后再缓慢吸移反应液20次使磁珠重悬。

b.室温静置15~30min。

6. 洗涤

a.在离心管内分别加入600 μL洗涤液II，以涡旋振荡器最大转速涡旋震荡3 min，室温静置5 min。将离心管置于磁性分离器上直至溶液澄清，用移液枪吸弃上清液并取下离心管。

b.在离心管内分别加入600 μL洗涤液II，以涡旋振荡器最大转速涡旋震荡2 min，将离心管置于磁性分离器上直至溶液澄清，用移液枪吸弃上清液。

7.干燥：保持离心管于磁性分离器上，室温静置5 min后，取下离心管。

注意：干燥过程中若发现反应管中有液体残留时，可用小量程移液器吸弃液体。

8.洗脱：在离心管内分别加入50-100 μL洗脱液，以涡旋振荡器最大转速涡旋震荡2 min，室温静置5 min。将离心管置于磁性分离器上直至溶液澄清，转移上清液至新的离心管中，此即为纯化得到的RNA，可保存于-70℃。

四．自动化提取流程

根据不同型号自动化核酸提取仪而定，详情请咨询我司技术支持或设备厂家技术支持。

注意事项

1.操作之前，请务必认真阅读本产品手册。

2.血液样本的质量对产物RNA的完整性有较大影响，应使用新鲜抗凝处理的全血样本，新鲜全血样本可暂存于2~8℃，避免冻融，应及时处理。

3.应避免对磁珠进行冷冻、高速离心等操作。磁珠每次取用前应充分重悬均匀。

4.应避免磁珠过度干燥，否则会严重降低核酸洗脱效率。

5.应使用无RNase的离心管和枪头。

6. 操作人员戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套。

7. 本产品为一次性使用，使用后请按医疗垃圾进行处理。

8.使用前请检查各组分是否存在析出情况，如有析出，请将试剂瓶置于60℃水浴加热溶解后使用。